Endotoxines bactériennes. Détermination des toxines endothéliales bactériennes L'endotoxine bactérienne à Gram négatif se caractérise par

Méthodes de suppression endotoxines bactériennesà partir d'échantillons biologiques.

Au sens large, les endotoxines sont des substances toxiques bactériennes qui sont des composants structurels des bactéries. Les endotoxines privées et les plus mentionnées sont les lipopolysaccharides (LPS). Les lipopolysaccharides sont des composants structurels des membranes des bactéries gram-négatives qui maintiennent la stabilité de la membrane. Il y a environ deux millions de molécules de LPS par cellule d'Escherichia coli. Malgré le fait que les endotoxines sont assez fermement liées à la membrane cellulaire, lors du processus de division et de mort des cellules bactériennes, la libération de endotoxines bactériennes. Présence endotoxines bactériennes dans les médicaments, en particulier ceux utilisés pour l'administration intraveineuse, est un énorme problème. Bien que les endotoxines elles-mêmes ne soient pas des substances toxiques, leur entrée dans l'organisme active le système immunitaire - principalement par l'activation des monocytes et des macrophages - ce qui conduit à la libération d'un certain nombre de médiateurs anti-inflammatoires, tels que le facteur de nécrose tumorale (TNF), les interleukines (en particulier IL-6 et IL-1) et d'autres agents. Le développement d'une réaction anti-inflammatoire en cascade, accompagnée de fièvre et de fièvre (appelé choc endotoxique), peut entraîner la mort.

Par rapport aux protéines, endotoxines bactériennes très stable. Leur stabilité est maintenue à des températures élevées et sur une large gamme de pH.

Des travaux décrivant l'effet toxique après administration intraveineuse de solutions préparées à partir de cultures bactériennes et ne contenant pas de micro-organismes ont commencé à être publiés à partir de la fin du XIXe siècle. Et le nombre de ces œuvres ne cesse d'augmenter.

En 1912, Hort et Penfold ont commencé à utiliser le terme "pyrogène" (pyrogène) pour désigner des solutions qui provoquent un état fébrile. En 1945, Westphal a publié un article dans lequel il décrivait un complexe de polysaccharides trouvé dans la couche externe de la paroi bactérienne qui avait un effet pyrogène.

Au cours des années suivantes, Westphal a publié plusieurs autres articles dans lesquels il a continué à étudier les liposaccharides de diverses entérobactéries. Au cours des années suivantes, l'organisation moléculaire des endotoxines et le mécanisme de leur action sur le corps ont continué à être étudiés.

Aussi appelés polysaccharides (LPS), ils sont le composant principal de la membrane externe des bactéries Gram-négatives (voir Figure 1).

Figure 1 : Modèle moléculaire des membranes interne et externe d'E. coli K-12
Formes : les ovales et les rectangles représentent les résidus de sucre, les cercles - les groupes de travail polaires de divers lipides.
Abréviations : PPEtn (pyrophosphate d'éthanolamine) ; LPS (lipopolysaccharide); Kdo (acide 2-céto-3-désoxyoctonique).

Ils sont constitués d'un résidu polysaccharidique hydrophile, qui est relié par une liaison covalente à un résidu lipidique hydrophobe (lipide A) (voir Fig. 2).

Les liposaccharides de la plupart des espèces bactériennes sont composés de trois blocs principaux :
- bloc O-antigène (région O-antigène),
- core oligosaccharide (core oligosaccharide),
- lipide A (lipide A).

L'antigène O est principalement constitué d'une séquence d'oligosaccharides identiques (de trois à huit monosaccharides chacun), qui déterminent la spécificité d'espèce et les caractéristiques sérologiques de la bactérie correspondante.
L'oligosaccharide central a une structure conservée avec une région interne d'heptose de l'acide 3-désoxy-D-manno-2-octulosonique (KDO) et une région externe constituée d'hexoses. Par exemple, cinq types différents de région centrale sont connus parmi les espèces d'E. coli.Le lipide A est la partie la plus conservée de l'endotoxine et est responsable de la plupart des propriétés biologiques de l'endotoxine, y compris sa toxicité biologique. Les souches bactériennes dépourvues de lipide A ou d'endotoxine dans leurs membranes ne sont pas connues de la science moderne.

Figure 2 : Structure chimique de l'endotoxine E. coli
(Hep) L-glycérol-D-manno-heptose; (Gal)galactose; (Glc)glucose; (KDO) acide 2-céto-3-désoxyoctonique; (NGa) N-acétylgalactosamine; (NGc) N-acétyl-glucosamine.

Le poids moléculaire du monomère d'endotoxine est typiquement compris entre 10 et 70 kDa. Mais il existe aussi des exceptions individuelles : 2,5 kDa avec un antigène O court jusqu'à 70 kDa avec un antigène O très long. Les cellules "perdent" des endotoxines en grande quantité au cours de leur mort, ainsi qu'au cours du processus de croissance et de division. Les endotoxines sont résistantes à hautes températures et ne sont pas détruits dans les modes d'autoclavage standard. Les endotoxines ne peuvent être détruites qu'en utilisant les modes suivants : 250°C pendant 30 minutes ou 180°C pendant plus de 3 heures. L'utilisation d'acides et d'alcalis avec une concentration d'au moins 0,1 M peut également conduire à la destruction d'endotoxines.

Méthodes d'élimination des endotoxines

Il existe un certain nombre de méthodes qui sont utilisées pour supprimer endotoxines bactériennes: chromatographie échangeuse d'ions, sorbants d'affinité, filtration sur gel, ultrafiltration, centrifugation sur gradient de saccharose, utilisation d'un système de séparation à deux phases.

La méthode d'élimination est déterminée par l'échelle et la faisabilité économique. Pour éliminer les endotoxines de grands volumes, l'ultrafiltration et la chromatographie échangeuse d'ions sont couramment utilisées. L'ultrafiltration est très efficace pour éliminer les endotoxines de l'eau et des solutions aqueuses, mais elle est totalement inadaptée en cas d'élimination des endotoxines de solutions contenant des protéines ou des acides nucléiques. Les mêmes inconvénients de l'ultrafiltration s'appliquent à la chromatographie échangeuse d'ions. L'utilisation de sorbants d'affinité, généralement immobilisés sur de l'agarose, du sépharose, de l'acrylamide et d'autres supports, est peut-être la plus efficace. façon efficace suppression endotoxines bactériennes. Les principaux inconvénients de cette approche sont : 1. la durée du processus d'élimination (il est nécessaire de faire passer l'échantillon à plusieurs reprises dans la colonne, le débit ne peut pas être élevé, car cela entraîne une déformation du sorbant), 2. la dilution de l'échantillon pendant la purification peut être de 10 à 100 fois, 3. le coût d'un sorbant d'affinité peut être très élevé.

Le système de séparation biphasique est le moyen le moins cher et le plus efficace d'éliminer les endotoxines. Le principe de base de cette méthode est la formation d'un système micellaire à deux phases grâce à l'ajout de Solution aqueuse polymère micellaire. Endotoxine bactérienne est capturé par les micelles résultantes de la partie hydrophile aqueuse et reste dans le milieu hydrophobe pendant la séparation de phase (voir Fig. 3).

Figure 3 : Schéma de séparation micellaire biphasique induite par élévation de température.
Des micelles peuvent également être présentes dans la phase aqueuse, mais leur taille est beaucoup plus petite que dans la partie inférieure hydrophobe.

L'utilisation de trois cycles de traitement par système biphasique réduit le niveau d'endotoxines dans toutes les protéines recombinantes obtenues à partir d'E. coli de plus de 99 %. Dans le même temps, l'activité biologique et les propriétés des protéines elles-mêmes ne changent pas.
L'inconvénient d'un système à deux phases est qu'après séparation, une certaine quantité du polymère formant des micelles ajouté reste toujours dans la phase aqueuse. Certains chercheurs pensent que les impuretés de ce polymère ont Influence négative avec une utilisation ultérieure de médicaments purifiés de cette manière. D'autres chercheurs réfutent un tel impact négatif. Notre expérience avec des préparations purifiées à partir d'endotoxines bactériennes à l'aide d'un système micellaire à deux phases, à la fois in vitro et in vivo, n'a montré aucun effet négatif ni sur les cellules ni sur les animaux injectés avec des préparations purifiées.
Apparemment, travailler avec un tel système nécessite certaines compétences, et leur manque peut se manifester dans les résultats ultérieurs.

Détermination des endotoxines

Le test LAL (LAL : Limulus Amebocyte Lysate) est couramment utilisé pour le dosage des endotoxines. Depuis les années 70, ce test a remplacé le soi-disant "test pyrogène" précédemment utilisé, lorsque le médicament testé était administré à des lapins. Les lapins sont très sensibles aux endotoxines et leur réaction aux drogues injectées a longtemps servi d'indicateur de pyrogénicité.
Le test EAA (EAA : Endotoxin Activity Assay) est désormais également utilisé. Ce test a été développé par Spectral Diagnostics Inc. (www.spectraldx.com) et permet de détecter le niveau d'endotoxines dans le sang.
Par classement international la concentration des endotoxines est indiquée en UE (unités d'endotoxines) : UE/ml ou UE/mg. Une unité (1 UE) correspond approximativement à 100 pg d'endotoxine. Une cellule bactérienne Gram-négative contient environ 10-15 g ou 1 fg d'endotoxine, donc 1 UE produit 105 bactéries. 1 ml de culture d'une nuit d'E. coli contient de 5 x 108 à 109 cellules, ce qui correspond à jusqu'à 10'000 UE pour 1 ml de culture.

Maximum niveau admissible endotoxine à administration intraveineuse- 5 EU par kg de corps par heure.

Basé sur les matériaux de l'article de CJSC Sileks. Réactifs pour l'élimination des endotoxines. www.sileks.com

D'une importance exceptionnelle dans la compréhension des mécanismes du développement maladies infectieuses joué la découverte de toxines bactériennes. Une page étonnamment intéressante dans l'étude des maladies infectieuses est la recherche consacrée, en particulier, aux lipopolysaccharides bactériens (endotoxines), qui, apparemment, n'est pas encore définitivement achevée.

R. Koch en 1884, lors d'une de ses conférences, discutant des mécanismes de développement du choléra, a exprimé l'opinion que la nature des changements pathologiques et anatomiques détectés chez les animaux de laboratoire avec injection intrapéritonéale d'une culture de vibrion cholérique suggère le rôle des bactéries poisons. Cette idée n'était pas en soi révolutionnaire puisque des études sur les toxines solubles (comme par exemple le bacille diphtérique) étaient déjà menées à cette époque aussi bien à Berlin (Behring et Kitasato) qu'à Paris (Roux et Yersin), mais elle orientait Richard Pfeiffer, étudiant de R. Koch, pour étudier plus en détail la pathogenèse du choléra.

C'est à la suite de ces travaux qu'a été décrite « une substance toxique associée à l'organisme par une cellule microbienne ». Pfeiffer a réussi à arriver à cette conclusion à la suite d'une «conception d'étude» bien composée, comme on dit maintenant, et d'une large interprétation hypothétique des résultats, puisque certains autres chercheurs ont travaillé avec une «substance toxique» similaire, en particulier, P. Panum, A. Cantani, H. Buchner.

Il faut reconnaître que la découverte de tout phénomène ou phénomène est facilitée non seulement et pas tant par le fait même de sa reproduction expérimentale ou clinique, mais par une interprétation hypothétique des résultats qui rentrerait dans la théorie généralement admise et ne serait pas violer les dispositions fondamentales. Pfeiffer a dû chercher une issue, comme il semblait initialement, à une situation désespérée. En tentant de reproduire les recherches de Pfeiffer, personne n'a pu détecter Vibrio cholerae dans cavité abdominale chez les animaux de laboratoire. Étant donné que les animaux sont morts et que le microbe n'y a pas été trouvé, cela contredit le «postulat de Koch-Henle» le plus important - l'isolement obligatoire de l'agent pathogène. Trouver une explication a nécessité une grande ingéniosité de la part de Pfeiffer pour confirmer et expliquer expérimentalement que la substance toxique de V. cholerae est associée au corps cellulaire microbien.

C'était une idée audacieuse et révolutionnaire, car elle contredisait une autre idée fondamentale de l'époque, qui expliquait à l'origine le développement de toute maladie infectieuse, à savoir l'activité vitale d'un microbe. Pfeiffer a fait le dernier point en confirmant la connexion de la substance toxique décrite avec le corps de la cellule microbienne en décrivant que la destruction thermique du vibrion cholérique n'affaiblit pas son potentiel toxique. Ainsi, à travers une série d'expériences élégantes basées sur une analyse approfondie et perspicace, Pfeiffer a formulé le concept d'endotoxine comme un poison étroitement associé à la cellule microbienne, libéré uniquement après sa mort, provoquant le développement de réactions pathologiques.

Curieusement, mais Pfeiffer dans ses premiers travaux évitait le terme "endotoxine", le désignant comme "toxine primaire du choléra", n'autorisant son utilisation que dans des présentations orales, par exemple lors d'une conférence à Bruxelles en 1903. Dans la littérature, le terme "endotoxine" a été utilisée pour la première fois en 1903 par J. Rehns, un employé de l'Institut Pasteur, qui travaillait auparavant à la Faculté de médecine de Paris et à l'Institut Paul Ehrlich de Francfort. Pfeiffer n'a utilisé le terme "endotoxine" pour la première fois dans un ouvrage imprimé qu'en 1904. Il y a une certaine ironie dans ce fait : le terme, proposé à l'Institut des maladies infectieuses de Berlin, a été utilisé pour la première fois en version imprimée par un employé de l'Institut Pasteur. Et cela malgré le fait qu'au début du XXe siècle, les deux principaux centres d'étude des maladies infectieuses - à Berlin et à Paris étaient dans la compétition scientifique la plus sévère, excluant tout contact officiel et échange d'informations, dont la priorité dans la recherche a été déterminant.

Étant donné que la structure chimique du biopolymère appelé endotoxine est encore Longtemps resté inexploré, le lysat bactérien obtenu par traitement thermique de culture de cellules microbiennes était généralement utilisé à des fins de recherche. L'absence de possibilité de standardisation et de comparaison des préparations obtenues a conduit les chercheurs, à partir de lysats bactériens, à décrire leurs différentes propriétés biologiques (notamment effets « protecteurs » et « nocifs »), sans même supposer que le principe actif dans tous les cas, le biopolymère est le même que le lipopolysaccharide (LPS).

Ainsi, en particulier, dès les années 90 du XIXe siècle (et jusqu'aux années 40 du XXe siècle), le chirurgien américain W. Coley a utilisé avec un certain succès des lysats de cellules microbiennes pour traitement conservateur sarcome des tissus mous, et H. Buchner en Allemagne a développé une "nouvelle hygiène" basée sur l'introduction lysats bactériens afin d'augmenter la résistance de l'organisme aux maladies infectieuses.

Il n'est devenu possible de terminer l'étude de la structure chimique de l'endotoxine et de déterminer les méthodes optimales pour son extraction que dans les années 1950, mais cela n'a pas clarifié la situation, mais a plutôt rendu ce biopolymère encore plus mystérieux. Il restait totalement incompréhensible que les endotoxines aient un spectre d'activité biologique aussi étonnamment invraisemblable, comprenant, d'une part, la participation au développement de maladies infectieuses, l'induction de fièvre, de DIC et de choc, et, d'autre part, elles sont un stimulant puissant système immunitaire, augmentant la résistance de l'organisme à l'infection, contribuant à la résorption de certains types de sarcomes. Il s'est avéré très difficile de rassembler des informations aussi divergentes sur l'activité biologique des endotoxines en un seul concept cohérent, nécessitant des études supplémentaires clarifiant les mécanismes moléculaires de leur action, ce qui n'est devenu possible que beaucoup plus tard.

L'attention principale des chercheurs s'est concentrée sur l'étude du rôle des endotoxines dans le développement des maladies infectieuses, ce qui a été largement facilité par la relative simplicité et l'accessibilité des études expérimentales. La spirale de ces travaux allait de pair avec les réalisations dans le domaine de toutes les sciences fondamentales, et la littérature originale, année après année, comme dans un miroir, reflétait le niveau des possibilités potentielles des recherches en cours. L'intensité des recherches en cours n'a cessé d'augmenter, car leur efficacité était d'une importance appliquée directe, en particulier dans le développement de méthodes et de méthodes de diagnostic, de traitement et de prévention des affections dans le développement desquelles les lipopolysaccharides jouent un rôle de premier plan. La chronologie des principales étapes de l'étude des lipopolysaccharides bactériens est présentée sur la figure.

Chronologie des principales étapes de l'étude des lipopolysaccharides bactériens (d'après Rietschel E.Th., Cavaillon J.-M., 2003).

Initialement, on pensait que les études sur l'étude du LPS bactérien ne se concentraient que sur la clinique des maladies infectieuses, mais leur signification pathologique générale est progressivement devenue claire.

Les principaux domaines de recherche de la seconde moitié du XXe siècle étaient:

1) étude du spectre d'activité biologique de la préparation de LPS purifié et de ses composants individuels ;

2) détermination des schémas de l'activité structurelle et fonctionnelle du LPS bactérien ;

3) étude du mécanisme d'action du LPS in vitro et in vivo ;

4) détermination du rôle du LPS dans la pathogenèse des maladies infectieuses ; et enfin

5) développement de méthodes de traitement. Étant donné que le développement de nouveaux schémas de thérapie pathogénique dépendait de notre connaissance et de notre compréhension des mécanismes d'action du LPS, c'est cette direction qui était une priorité dans la recherche clinique.

W.H. Welch en 1888 (cité dans Atkins E., 1984) fut l'un des premiers à suggérer que les agents microbiens provoquent le développement de la fièvre de manière indirecte, favorisant la libération d'"enzymes", éventuellement issues des leucocytes, qui agissent déjà directement sur le système nerveux central. Menkin W. dans les années 40 du XXe siècle a formulé une hypothèse selon laquelle l'effet de l'endotoxine (LPS) sur le corps est médié par des médiateurs produits par les cellules du corps. Déjà dans les années 1950, les capacités des sciences fondamentales permettaient de mener des études à grande échelle sur le rôle de divers médiateurs endogènes dans la mise en œuvre de l'action biologique des endotoxines.

Les travaux expérimentaux sur l'induction de la fièvre revêtent une importance particulière pour prouver l'exactitude de l'hypothèse avancée. Dans l'une des premières études fondamentales menées par Bennett I.L. et Beeson P.B. en 1953, il a été constaté que lorsqu'un extrait cristallin d'exsudat inflammatoire aigu (« pyrexine de Menkin ») et divers agents microbiens sont injectés à des animaux de laboratoire, on retrouve dans leur sang du « pyrogène leucocytaire ». endotoxémie , et chez les patients atteints de diverses maladies infectieuses causées par des bactéries gram-négatives, la participation de systèmes de régulation tels que la rénine-angiotensine-aldostérone, la kallikréine-kinine, l'histamine et de nombreux autres systèmes dans le développement de la réponse de l'organisme au LPS a été établie.

Les années 70-80 sont marquées par une étude détaillée des mécanismes moléculaires de régulation des fonctions cellulaires de l'organisme sous l'action des endotoxines. Une place particulière dans ces études était occupée par des études sur le rôle des prostaglandines, dont une augmentation de la synthèse dans les infections expérimentales à Gram négatif a été établie dans les travaux de R.A. Giannella (1973-1979). Au cours de ces années, ce sont les prostaglandines qui ont joué le rôle principal dans le développement de la réponse inflammatoire induite par les endotoxines bactériennes. En 1976-1982 nous avons mené une série d'études cliniques et expérimentales pour clarifier l'importance des prostaglandines dans le développement du syndrome d'intoxication dans les infections intestinales aiguës.

En particulier, il a été constaté que les endotoxines d'entérobactéries sont capables d'améliorer de manière significative la biosynthèse des prostaglandines à partir de l'acide arachidonique (S.G. Pak, M.Kh. Turyanov, 1979), qui, à leur tour, interviennent dans le développement troubles fonctionnels du côté de l'hémostase, de l'hémodynamique et d'autres systèmes du macro-organisme. La conclusion logique de cette série de travaux était la justification de l'utilisation précoce des inhibiteurs de la biosynthèse des prostaglandines dans le traitement des patients atteints d'endotoxinémie (SG Pak et al., 1988).

Plus tard, les cytokines ont été étudiées dans le même détail, ce qui a permis d'établir la relation entre le niveau de certaines d'entre elles (principalement le TNF-β et l'IL-1) et le développement du choc toxique.

Avec l'expansion de notre compréhension des mécanismes d'action des LPS bactériens, des tentatives ont été faites à plusieurs reprises pour utiliser diverses classes préparations pharmacologiques, dont le point d'application était les « maillons clés de la pathogenèse » de l'endotoxinémie (tableau 2).

Tableau 2

Les principales étapes de l'étude des mécanismes d'action des endotoxines et propositions de méthodes pathogéniques pour le traitement de l'endotoxémie

Bien que les études cliniques et expérimentales en cours aient donné un certain espoir quant à l'efficacité thérapeutique de ces médicaments dans l'endotoxinémie, aucun d'entre eux n'est devenu le médicament de choix.

Ces études peuvent être considérées comme une continuation de la recherche fascinante de la « solution miracle » (selon Paul Ehrlich) et de la création de « médicaments miracles », comme on appelait les médicaments antibactériens jusqu'à récemment, mais en fait, ils servent de reflet de l'étendue et de la profondeur de notre compréhension des subtilités des mécanismes pathogéniques du développement des maladies infectieuses.

Et il faut reconnaître que plus nous connaissons les mécanismes du développement des maladies infectieuses, plus nous comprenons clairement et distinctement qu'il ne peut y avoir de remède universel. La "clé d'or" pour résoudre le problème de l'augmentation de l'efficacité de nos mesures thérapeutiques et préventives contre les maladies infectieuses est une étude approfondie du processus infectieux avec la prise en compte obligatoire du fonctionnement des systèmes de défense naturels (naturels) du macro-organisme.

"La maladie est un drame en deux actes,

dont le premier se joue dans le silence maussade de nos étoffes,

aux bougies éteintes.

En cas de douleur ou d'autres phénomènes désagréables,

c'est presque toujours le deuxième acte."

"La fièvre est le mécanisme le plus puissant

que la nature a créé pour soumettre ses ennemis"

Sydenham, médecin anglais du XVIIe siècle

Dermatovénéréologie, Direction nationale, 2011, p.99-110

Endotoxine intestinale et inflammation

M.Yu. Iakovlev

Le niveau actuel des connaissances scientifiques vous permet de donner une inflammationla définition suivante : « L'inflammation est un mécanisme d'urgencedéfense immunitaire, visant à reconnaître, détruireet l'élimination des antigènes étrangers et du soi, portantcaractère adaptatif et/ou pathogène ». En d'autres termes, lele brûlage est toujours un processus destructeur, même quand il est vital nécessaire.

Une définition interdisciplinaire formulée dans III congrès Société russe pathologistes, sur la base des enseignementsJe.Je. Mechnikov "Sur le rôle du facteur intestinal dans les mécanismes derhénium"; concepts de G. Selye "Syndrome d'adaptation générale" à propos causes profondes facteurs non spécifiques ; "Clonal-Selection Theory of Immunity" de F. Burnet et "Endotoxin notions de physiologie humaine et de pathologie.

Ces théories scientifiques ont stimulé les études cliniques, moléculairesla recherche scientifique et génétique, qui a permis de systématiserdonnées précédemment obtenues sur le travail de l'immunité innée et adaptative, leur interaction les unes avec les autres et infectieusesagents. Connaissance de cet aspect du problème jusqu'à récemmentétaient fragmentés et ne permettaient pas d'obtenir desdéclarations sur les mécanismes de régulation du système immunitaire par lesendotoxine au niveau de tout l'organisme et la participation de l'ensemblefacteurs "non spécifiques" dans la mise en place et l'initiation de l'inflammationcar sans la participation du facteur systémique, il est impossible etses manifestations locales.

Endotoxine - thermostable composant de la partie externe de la membrane cellulaire de tous les micro-organismes gram-négatifs, lipopolysaccharide(LPS), composé de 3 parties : hydrophobe lipide A - glycolipide Concernant- chémotype, identique à endotoksynovs de tous les micro-organismes gram-négatifs; noyau hydrophile et polysaccharide, qui sont individuels et permettentdétecter les organismes Gram-négatifs avec sérométhodes de recherche logique. La présence d'un glycolipide dans la molécule de LPS d'origines diverses détermine la communauté de leurspropriétés biologiques : effet pyrogène et antitumoralcomov, la capacité d'activer la différenciation cellulaire myélocytairela moelle osseuse et la peroxydation des lipides,stimuler l'immunité antivirale et antibactérienne,

induire des syndromes de coagulation intravasculaire disséminée etorgane multipleinsuffisance.

Tout ce spectre unique d'activité biologique des endotoxines jusqu'àrécemment (jusqu'en 1987-1988) étaient considérés exclusivement au format sepsis et d'autres maladies infectieuses, dans la pathogenèse dont il a été supposéle rôle prépondérant des LPS des bactéries gram-négatives exogènes. La participation de l'endotoxine intestinale dans la pathogenèse de la "pathologie non infectieuse", et plus encore dans les processus physiologiques d'adaptation, n'a pas été envisagée. On a supposé que dans une bonne santéle corps de la toxine (endotoxine) ne devrait pas être par définition. Même chose pour moiL'auteur de ce chapitre était également une source d'information, tandis qu'avec l'aide d'anticorps hautement purifiés contre Concernant -glycolipide dans les frottis sanguins périphériques de patients apparemment en bonne santéaucun LPS fixé sur la surface n'a été trouvé polymorphonucléaire les leucocytes.

Cela a permis de postuler un nouveau phénomène biologique - systémiqueendotoxémieet suggèrent un rôle important du LPS intestinal dans la régulationl'activité immunitaire et l'initiation de l'inflammation. Tout d'abord, de nouvelles méthodes de recherche ont été développées, une gamme d'outils normatifs logique") indicateurs de la concentration d'endotoxine dans le sérum et de la quantitéLPS-positifpolymorphonucléaire leucocytes dans le sang périphériquevolontaires conditionnellement sains ; puis le fait de la participation d'un excès de LPS dans la pathogenèse de diverses maladies a été établi, appelé par la suite "endotoxineagression"; et, enfin, des récepteurs immunitaires innés ont été identifiés niteta - TLR 4 interagissant avec le LPS et déterminant l'activité des système noé.Ainsi, l'un des principaux éléments a été vérifiéendotoxinémie systémique précédemment postulée, moléculairemécanismes immunorégulateur action du LPS intestinal, qui se réalise, ainsi queprécédemment supposé, avec la participation directe de l'hypothalamo-hypophyse-système surrénalien. stress (physique, psycho-émotionnel, d'étiologie différente) provoque une décharge supplémentaire par des anastomoses porto-caves de sang portal riche en endotoxine intestinale, contournant le foie, dans la circulation générale. Dans un état de repos relatif, c'est-à-dire en l'absence de stressimpacts, plus de 95 % du sang portal pénètre dans le foie, où tous les LPSéliminés par le système des macrophages fixés. Le foie est le plus "nécessairedonnée » dans les endotoxines, l'organe, puisque lorsqu'elles interagissent avec TLR 4 pouces les macrophages ont induit la synthèse des plus importants pro-inflammatoire cytok- Nouveau, fournissant le tonus physiologique de base de l'antitumoral, antiimmunité bactérienne et antivirale 1 . LPS non consommé par le foie avec la bile retourne à l'intestin, mais, très probablement, déjà sans le polysaccharide les pièces.Une partie de l'endotoxine (moins de 5 %) vient avec le sang porte vers le général hémocirculationet maintient dans un état de tonus physiologique tous immunocompétentorganes (moelle osseuse, thymus, etc.) et cellules ( présentateur d'antigène, polymorphonucléaire leucocytes, lymphocytes, etc.). Ainsi, systémiquel'endotoxinémie remplit une fonction extrêmement importante pour assurer le tonus physiologique du système immunitaire. Pour les situations extraordinaires(peur, peur, orgasme, effort physique), toujours accompagné de stress,l'effet immunostimulant de l'endotoxinémie est renforcé à mesure que la concentration de LPS intestinal dans la circulation générale augmente. Évidemment, donc, physioles concentrations logiques d'endotoxines fluctuent dans une très large gamme (de près de zéro à 1,0 UE/ml ) et ont une tendance à la hausse constante.avec l'âge. En très Cas rares Le LPS dans le sérum ne peut pas être détecté (ou plutôt,sa concentration est inférieure à 0,0001 UE/ml ). Pour ces patients, laterno une diminution significative des principaux indicateurs de l'état immunitaire. Cependant, il y a aussi le phénomène de tolérance aux endotoxines - le manque de caractèreréaction pyrogène épineuse à un niveau suffisamment élevé (dépassant nettementlimite supérieure de la normale) concentrations d'endotoxines dans le sang. Pour la mise en œuvrepropriétés biologiques de l'endotoxine (en particulier, pour l'interaction du LPS avec TLR 4) lipoprotéines de haute densité (HDL) requises LPS-binding prola théine (une protéine de phase aiguë synthétisée par le foie) qui transfère les endotoxines Récepteur CD 14, et quelques autres molécules protéiques et cofacteurs. déficitun ou plusieurs des facteurs ci-dessus, dont la plupartsynthétisé dans le foie, peut provoquer immunodéprimé affections les plus fréquemment associées à l'utilisation d'anti-inflammatoires chez les patients insuffisants hépatiques et les patients atteints deLe LPS dans la circulation générale est inférieur à 0,0001 UE/ml.

1 Hc'est probablement pourquoi les animaux gnotobiontes sont pratiquement sans défense contre l'infectionet sont beaucoup plus susceptibles de développer un cancer. Animaux "microbiens"privés de l'effet immunostimulant du LPS intestinal, car ils n'ont pas de Gram négatifmicroflore. (Accepter, auth.)

Pour une compréhension plus globale du matériel présenté, nous avons trouvé opportunrésumer au sens figuré les principes fondamentaux du travail du système immunitairesystèmes et interactions de l'immunité innée et adaptative.

l'immunité innée en raison de l'activité de plusieurs centaines d'embryonsgènes respiratoires qui assurent la synthèse du nombre correspondant de récepteurs.Ce sont eux qui participent à la lutte contre l'infection dans les 3 à 5 premiers jours (avant la formationclones de lymphocytes et développement d'un pool d'anticorps spécifiques) due à l'activation du complément, à l'action de peptides antimicrobiens et à l'activité des phagocytes. De plus, l'immunité innée "organise" le travail d'adaptation, en particuliersti, en raison de l'interaction du LPS avec TLR 4 2 et enseignement principal pro-inflammatoire des cytokines qui assurent la mise en place d'une réponse immunitaire spécifique.Ainsi, le système évolutif plus ancien de l'immunité innéegère un adaptatif plus "jeune".

immunité adaptative en grande partie fourni par un processus aléatoiremutations somatiques des lymphocytes, à la suite desquelles apparaissent des récepteurs,capable de reconnaître tout antigène (même synthétique), y compris les auto-antigènes, les anticorps (À ) qui sont constamment présents dans la circulation générale.Le nombre de ces récepteurs dans des conditions physiologiques atteint des proportions astronomiquesvaleurs cal. Ce principe d'organisation de l'immunité adaptative permet de fournir un système fiable de protection de l'organisme contre les infections et potentiellementmutations nuisibles, d'une part, et d'autre part, comporte un grand dangerdommages auto-immuns. Le fait queque l'immunité innée est impliquée dans la régulation de ce processus, dont l'activité, à son tour, est largement déterminée par la concentration de LPS dans l'organisme général débit sanguin.

L'immunité innée et adaptative fonctionnent en tandem, ce qui peut être illustré par l'exemple des phagocytes, qui sont également activés par lesendotoxine. La plus grande population immunocompétent cellulesest au sommet de l'interaction entre l'immunité innée et adaptative en raison deprésence à sa surfaceFCrécepteurs capables d'accepter

tout à , ce qui signifie interagir spécifiquement avec une variété d'antigènes, ce qui permet de caractériser le neutrophile comme un phagocyte multispécifiqueaction, qui était auparavant cachée sous le terme " non-spécificité».

Dans des conditions physiologiques, 5 à 7 % des leucocytes circulants poursuivent leursurface de LPS, et approximativement le même nombre de phagocytesnous lions les endotoxinesdans in vitro. Lors de l'interaction avec le LPS, phagocytairele potentiel des neutrophiles et leur activité adhésive augmentent. Ils partentle lit vasculaire, puis le corps (dans la composition des excrétions : fèces, urine, sueur, etc.), remplissent la fonction protectrice de « gardes-frontières kamikazes » dans le stroma des organes ettissus en contact direct avec l'environnement.

Ainsi, systémique endotoxinémie (SEE) - mécanisme de régulation de l'activité immunitaire par le LPS intestinal lors d'une étude directe stii du système hypothalamo-hypophyso-surrénalien. le stress, qui estun attribut de la vie lui-même, d'une part, fournit une injection dans la circulation sanguine généraleune portion supplémentaire d'universel immunostimulant, et de l'autre - le champtrès puissant pro-inflammatoire l'effet de son excès par synthèse accrueglucocorticoïdes(Fig. 8-1). Il en résulte un état très instable.dit "équilibré statut immunitaire", qui dans des conditions deexactement une longue période d'adaptation (stress prolongé) peut êtreviolé. Une augmentation de la concentration de LPS intestinal dans la circulation générale peut dépassent les valeurs physiologiquement acceptables (elles sont purement individuelles et ont des caractéristiques liées à l'âge) et constituent la seule raison d'initiationréaction inflammatoire locale (ou son exacerbation) et systémiqueréponse inflammatoire, plus ou moins sévère, accompagnant toujours l'inflammation (augmentation de la température corporelle, de la concentration en protéinesphase aiguë, ESR ;leucocytose, etc.). unl'adaptation de l'organisme aux conditions constamment changeantes des facteurs externes et environnement interne est directement impliqué dans la réglementationactivité immunitaire et initiation de l'inflammation, indirectement - dans une augmentationconcentrations d'endotoxines intestinales dans la circulation générale. Alors le stresspeut être la seule raison du développement de l'agressivité des endotoxines et, comme Le résultat est une inflammation.

Riz. 8-1. Endotoxinémie systémique - état immunitaire équilibré.

Riz. 8-2. L'agression des endotoxines comme cause d'inflammation.

Endotoxine agression- un processus pathologique causé par un excèsmasse de LPS d'origine intestinale et/ou autre dans la circulation générale, ayantses manifestations cliniques et de laboratoire, est une "pré-maladie" ou unifacteur commun universel dans la pathogenèse des maladies et des syndromes, qui se manifeste par l'une ou l'autre forme nosologique de la maladie due à la conprédisposition institutionnelle et/ou acquise 3 . Ce breakL'effet de l'agression des endotoxines est réalisé d'au moins trois façons :induction de réactions auto-immunes (dues aux caractéristiques de l'immunité adaptative), la formation hyperergique contexte immunitaire et autoagressivitéles leucocytes. Les raisons du développement de l'agressivité des endotoxines sont très diverses : le plus courant est le stress, ainsi que tout processus pathologique entraînant une augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale (intoxication alimentaire et infections intestinales, excès d'alcool et dysbactériose, inhabituellement gras et la nourriture épicée, épicée infections virales, choc, etc.), hypertension portale et maladie hépatique, insuffisance rénale chronique et aiguë (puisque les reins sont le principal organe excrétant le LPS).Le plus clairementmécanisme pro-inflammatoire actions sous une forme très simplifiée (Fig. 8-2)peut être représenté par l'exemple du stress à long terme ( psycho-émotionnel surcharge, dépression, hyper et hypothermie, activité physique extrême, etc.).

3 L'introduction de ce terme a été précédée d'études à long terme de nombreuxet scientifiques étrangers, y compris la création de méthodes disponibles pour la pratique clinique pour déterminer les indicateurs intégraux de la concentration et de l'activité du LPS antiendotoxineimmunité, détermination d'indicateurs normatifs. C'est pourquoi nous nous limiterons dans ce chapitre aux plus importants d'entre eux. (Accepter, auth.)

induit par le stresspro-inflammatoire l'effet des endotoxines dans la définitiondans une certaine mesure est arrêté par l'action opposée glucocorticoïdes. Pourla synthèse de ces hormones utilise le cholestérol entrant dans la couche corticaleglandes surrénales exclusivement en association avec des lipoprotéines de haute densité (HDL), dont l'affinité pour le LPS est bien supérieure à celle pour le cholestérol. C'est pourquoi un excès d'endotoxines provoque une carence en HDL, qui bloque partiellement la synthèse glucocorticoïdes et conduit à une augmentation pro-inflammatoireeffet. En conséquence, il se développe hypercholestérolémie et augmente" athérogène index », qui pendant de nombreuses années a été considéré à tort comme la manifestation d'une violationmétabolisme des lipides et base du développement de l'athérosclérose. A l'heure actuelle, il y a peuqui ont des doutes sur le caractère inflammatoire de l'athérosclérose, en particulier sur le rôle du « dysfonctionnement endothélial » dans son déclenchement (le dysfonctionnement endothélial, quant à lui, est induit par l'agression des endotoxines, prédite dès 1987). Ce concept est confirmé de manière très convaincante par une diminution de la concentration des fractions lipoprotéiques « athérogènes » (faibles et trèsfaible densité) avec une diminution du niveau de LPS (<1,0 UE/ml) dans le sérum sanguin.

Selon leur structure chimique, les endotoxines sont un complexe complexe constitué d'une protéine non toxique et d'un phospholipidopolysaccharide, qui peut résister à un chauffage jusqu'à 80-100 ° C. Les endotoxines sont moins toxiques que les exotoxines et n'ont pas d'effet spécifique sur le corps humain. Quel que soit le microbe auquel appartient l'endotoxine, son effet sur le corps est similaire et se manifeste par une image d'empoisonnement général.

L'empoisonnement du corps des patients avec des endotoxines se produit dans la plupart des maladies infectieuses.

Dans ce cas, le système vasculaire est endommagé par un spasme de petits vaisseaux et la formation de caillots sanguins dans ceux-ci. La privation d'oxygène des tissus se développe. Il y a une violation des fonctions du système nerveux central, du cœur, des reins et d'un certain nombre d'autres organes vitaux. Les endotoxines provoquent également une réaction fébrile, des changements inflammatoires locaux et une diminution du nombre de leucocytes.

Un degré extrêmement grave d'empoisonnement du corps par des endotoxines est connu en clinique sous le nom de choc endotoxique.

Cette condition survient lorsqu'il y a une dégradation rapide dans le corps d'un grand nombre de microbes et qu'en même temps une énorme quantité d'endotoxine est libérée en même temps. La destruction des microbes se produit soit sous l'influence de facteurs protecteurs de l'organisme, soit lors de l'utilisation thérapeutique de tels médicaments qui ont; action microbicide (c'est-à-dire, tuant les microbes), comme la pénicilline ou la streptomycine.

La circulation de l'endotoxine dans la circulation générale n'entraîne pas la formation de quantités significatives d'anticorps anti-endotoxiques dans l'organisme, de sorte que l'immunité anti-endotoxique est très faible.

Il n'est pas possible d'obtenir un sérum antiendotoxique suffisamment efficace par immunisation répétée des animaux, car les endotoxines sont de mauvais antigènes et, de plus, diffèrent par leur hétérogénéité antigénique.

Etant donné qu'il est pratiquement très difficile d'obtenir et de sélectionner le sérum thérapeutique souhaité, les sérums antiendotoxiques n'ont pas trouvé une large application dans le traitement des patients. Lorsque les animaux sont immunisés avec des bactéries, des anticorps ne sont pas produits contre les endotoxines, mais contre les microbes eux-mêmes, c'est-à-dire que l'immunité a un objectif antimicrobien.

"Infections de quarantaine", B.A. Mokrov

Le terme "pyrogène" vient du grec "pyreto" - fièvre. Les pyrogènes sont des substances qui peuvent provoquer une augmentation de la température corporelle. La réaction pyrogène peut provoquer des substances de nature et d'origine très différentes. Les pyrogènes comprennent les bactéries gram-négatives et leurs toxines, les bactéries gram-positives et leurs toxines, les virus et leurs produits métaboliques, ainsi que les stéroïdes, etc. Dans le domaine du contrôle qualité des médicaments injectables, endotoxines bactériennes, qui sont des fragments de la paroi externe des bactéries Gram-négatives.

Les bactéries Gram-négatives ont une paroi cellulaire bicouche qui entoure la membrane cytoplasmique. La première couche est une membrane non lipidique très fine (1 nm d'épaisseur) constituée de peptidoglycane. Il est aussi appelé glycopeptide ou mucopeptide. Il s'agit d'une matrice complexe contenant des chaînes polysaccharidiques liées entre elles par des réticulations de courtes chaînes peptidiques. La deuxième couche de la paroi cellulaire est une membrane lipidique de 7,5 nm d'épaisseur. C'est sur cette membrane externe que se trouvent les endotoxines (lipopolysaccharides). Les molécules d'endotoxines assurent l'intégrité structurelle et sont responsables de nombreuses fonctions physiologiques, y compris la détermination des propriétés pathogènes et antigéniques des bactéries. Structurellement, la molécule d'endotoxine est divisée en trois parties - Lipide A, Kor et Circuit spécifique O.


Chaîne spécifique O Core Lipid A
Lipide A se compose d'un disaccharide, de phosphate et d'acides gras. Les acides gras qui composent le lipide A peuvent être saturés ou insaturés. Le plus souvent, le Lipide A contient des acides : palmitique, laurique, glutamique, méristique. La région du lipide A est la région la plus constante de la molécule de LPS et sa structure est similaire chez de nombreuses bactéries.
Chaîne spécifique O les lipopolysaccharides sont construits à partir d'oligosaccharides répétitifs. Les sucres les plus courants qui composent la chaîne O-spécifique sont le glucose, le galactose et le rhamnose. Cette région de la molécule lui confère des propriétés hydrophiles, grâce auxquelles les LPS sont très solubles dans l'eau. La partie polysaccharidique est la partie la plus variable de la molécule de LPS. Souvent, ce fragment de la molécule est appelé l'antigène O, car c'est lui qui est responsable de l'activité antigénique des bactéries gram-négatives.
Kor- la partie centrale de la molécule qui lie l'antigène O au lipide A. Formellement, la structure centrale est divisée en parties externe et interne. La composition de la partie interne du noyau comprend généralement des résidus de L-glycéro-O-mannoheptose et d'acide 2-céto-3-désoxyoctonique (KDO). BWW contient 8 atomes de carbone et ne se trouve presque nulle part ailleurs dans la nature.
En plus des lipopolysaccharides, la paroi externe des bactéries gram-négatives comprend également des protéines (la membrane externe est constituée de ¾ de LPS et seulement de ¼ de composants protéiques). Ces protéines, avec le LPS, forment des complexes protéine-lipopolysaccharide de différentes tailles et poids moléculaires. Ce sont ces complexes que l'on appelle endotoxines bactériennes. Les préparations purifiées utilisées comme étalons sont dépourvues de fragments peptidiques et représentent une préparation lipopolysaccharidique pure. Cependant, le terme "endotoxines bactériennes" s'applique avec autant de succès aux endotoxines naturelles qui se sont retrouvées en solution à la suite de la destruction de bactéries, et aux préparations de LPS purs.
La paroi externe d'une bactérie Gram-négative peut contenir jusqu'à 3,5 millions de molécules de LPS. Après sa mort, ils finissent tous en solution. Les endotoxines des bactéries gram-négatives restent des molécules biologiquement actives même après la mort des bactéries. La molécule d'endotoxine est stable en température et résiste facilement au cycle de stérilisation en autoclave. La petite taille des molécules d'endotoxines leur permet de traverser facilement les membranes utilisées pour stériliser les solutions (0,22 µm). Par conséquent, des endotoxines peuvent être présentes dans des formes posologiques finies, même si elles sont produites dans des conditions aseptiques et ont subi une stérilisation finale.
Les endotoxines bactériennes sont des pyrogènes extrêmement actifs (forts). Pour le développement d'une attaque fébrile, la présence d'endotoxines bactériennes dans la solution de perfusion à une concentration de 1 ng/ml (environ 10 UE/ml) est suffisante. D'autres pyrogènes sont moins actifs et, pour le développement d'une réponse pyrogène, leur concentration doit être 100 à 1 000 fois supérieure. Les termes "pyrogènes" et "endotoxines" sont généralement utilisés de manière interchangeable et, bien que tous les pyrogènes ne soient pas des endotoxines, les plus importants sont les endotoxines des bactéries gram-négatives.